Physiological and biochemical analysis of PDR-like ABC transporters in Nicotiana species

T. Trombik, J. Crouzet, E. Ducos, S. Fraysse, B. Cuenca Bono, E. Peeters and M. Boutry
Université Catholique de Louvain, Institut des Sciences de la Vie - Unité de Biochimie Physiologique
Louvain-la-Neuve- BELGIUM
 
 
In Arabidopsis and rice, ABC (ATP Binding Cassette) transporters constitute a large gene family of about 150 genes (Sanchez-Fernandez et al., 2001; Jasinski et al., 2003). Full-size MDR and MRP genes are common to animal and plant kingdoms whereas PDR (Pleiotropic Drug Resistant) transporters have been found only in plants and fungi. We have obtained several cDNA clones, NpPDR1, NpPDR2, NtPDR1 and NtPDR3 encoding PDR transporters in Nicotiana tabacum and N. plumbaginifolia.
In order to better characterize their biochemical properties, we tested several expression systems. Although plant plasma membranes H⁺-ATPases have been successfully expressed in the yeast Saccharomyces cerevisiae, this heterologous expression system was not very effective for plant PDRs: these were not expressed at a detectable level or were not able to reach the plasma membrane. On the contrary, we were able to express PDRs in N. tabacum suspension cells, thus allowing us to biochemically characterize these transporters.
To decipher the physiological roles of PDR transporters, we have obtained transgenic plants and cell lines in which PDR expression is prevented by RNA interference. For instance, NpPDR1 was shown to transport the antifungal diterpene sclareol (Jasinski et al., 2001). In addition, NpPDR1 expression was strongly induced in the leaf after insect or microbial aggression, suggesting that this ABC transporter is involved in plant defense. Silencing NpPDR1 expression by RNA interference resulted in plants that became more sensitive to Botrytis cinera, a fungal pathogen (Stukkens et al., 2005). Silencing NpPDR2 resulted in another  phenotype: the plants were male sterile but could be rescued by crossing with wild-type pollen. The silencing approach was therefore very valuable  in unraveling physiological roles of plant PDR transporters.
 
Sanchez-Fernandez, R., Davies T.G., Coleman, J.O. and Rea, P.A. (2001) The Arabidopsis thaliana ABC protein superfamily, a complete inventory. J. Biol. Chem. 276, 30231-30244.
Jasinski, M., Ducos, E., Martinoia, E. and Boutry, M. (2003). The ATP-binding cassette transporters: structure, function, and gene family comparison between rice and Arabidopsis. Plant Physiol. 131, 1169-1177.
Jasinski, M., Stukkens, Y., Degand, H., Purnelle, B., Marchand-Brynaert, J. and Boutry, M. (2001). A plant plasma membrane ATP binding cassette-type transporter is involved in antifungal terpenoid secretion. Plant Cell. 13, 1095-1107.
Stukkens, Y., Bultreys, A., Grec, S., T. Trombik, D. Vanham and Boutry, M. (2005). An ABC transporter is involved in the plant pathogen-response. (Submitted).

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Study of an ABC transporter involved in iron uptake in Pseudomonas aeruginosa

Journet L ¹, Adams H ¹, Poole K ², Schalk I J ¹

 ¹Laboratoire Métaux et Micro-organismes, UMR7100, Récepteurs et Protéines Membranaires, Ecole Supérieure de Biotechnologie de Strasbourg, Illkirch, Strasbourg, France

²Department of Microbiology and Immunology, Queen's University, Kingston, Ontario, Canada

 Under iron-limiting conditions, Pseudomonas aeruginosa secretes in the extracellular environment a major fluorescent siderophore called pyoverdin. Pyoverdin then chelates free iron and the resulting ferric-pyoverdin complexes are taken up back into the periplasm through a specific outer membrane receptor called FpvA. In Gram negative bacteria, the ferric-siderophores are then translocated across the cytoplasmic membrane by a specific ABC transporter. In P. aeruginosa, the ABC transporter involved in iron uptake via pyoverdin has not been identified yet. We found a cluster of three neighboring genes located in a region encoding genes involved in pyoverdin biosynthesis, which are likely to correspond to the periplasmic binding protein, the permease and the ABC cassette subunits of an ABC transporter. We cloned these genes and the periplasmic binding protein was expressed in E.coli and purified to produce polyclonal antibodies. We showed that the expression of the PBP is enhanced in iron-limiting conditions. Radiolabeled ferric-pyoverdin uptake is decreased in a periplasmic binding protein deficient mutant. These data suggest that this ABC transporter could be involved in the uptake of iron via pyoverdin.

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 Analyse de l’activité des P-glycoprotéines chez un nématode parasite, rôle dans la chimiorésistance

 Dominique Kerboeuf, Mickaël Riou, Fabrice Guégnard, Yves Le Vern, Christine Koch et Marie Fassot

INRA, Unité Bioagresseurs, Santé, Environnement, 37380 Nouzilly, France

 Les résistances non spécifiques assimilables à la « multidrug resistance » (MDR) des cellules tumorales jouent aussi un rôle essentiel dans les échecs thérapeutiques liés à l’utilisation d’antiparasitaires. Notre équipe a montré la présence et l’importance des « pompes cellulaires » d’efflux à localisation membranaire, les P-gp (P-glycoprotéines) dans le transport des anthelminthiques. Nous avons détecté la présence de P-gp actives dans les enveloppes protectrices des parasites, coques des œufs, cuticules des larves et des vers adultes. Un retour partiel à la sensibilité, dépassant les 50 %, d’isolats de parasites hautement résistants, a été obtenu grâce à la combinaison d’anthelminthiques à différents inhibiteurs chimiques des P-gp. Cependant, ceux-ci présentent aussi une toxicité pour l’hôte. Une régulation plus spécifique de l’efflux des antiparasitaires pourrait être réalisée par action sur l’environnement membranaire des pompes comme cela a été proposé dans d’autres modèles biologiques. Nous avons exploré cette possibilité chez les nématodes. Les transports transmembranaires des xénobiotiques ont été étudiés à l’aide de deux groupes de composés (rhodamine 123 en tant que substrat connu des Pgp et anthelminthiques en tant que substrats potentiels). Les résultats ont clairement démontré l’effet inducteur plus ou moins prononcé des anthelminthiques sur les P-gp ainsi que le rôle important du cholestérol dans l’activité de ces pompes. Des perspectives sont ainsi offertes de régulation des pompes par leur environnement membranaire. Les nématodes ne synthétisent pas ou peu le cholestérol qu’ils prélèvent à leurs hôtes. Ce moyen de régulation des pompes pourrait ainsi être spécifique du parasite et utilisé pour l’amélioration des traitements. Le mécanisme de cette régulation a été analysé. La fluidité membranaire, reflet des changements biochimiques et physiques de la membrane, s’est révélée être une composante en relation directe avec l’activité des pompes. L’analyse plus précise des relations lipides membranaires / Pgp est en cours.

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P-glycoprotéine, plexus choroïdes et stéroïdes sexu els chez la brebis.

Bougoin Sylvain, Lomet Didier, *Kerboeuf Dominique, *Le Vern Yves et Thiery Jean-Claude;

INRA, PRC et *INRA BASE ; Centre de Recherche de Tours, 37380, Nouzilly

thiery@tours.inra.fr

La brebis est un animal à reproduction saisonnière où l’arrêt de la cyclicité au printemps et en été dépend d’une augmentation de la rétroaction négative des stéroïdes sexuels sur la libération pulsatile de GnRH. Cette augmentation de la rétroaction dépendrait d’une augmentation du nombre des récepteurs centraux aux stéroïdes, selon la littérature, mais nous avons également mis en évidence au laboratoire une augmentation concomitante des concentrations centrales en progestérone et oestradiol dans le liquide cérébrospinal (LCS), à concentration sanguine égale (Thiery et al, 2003). Nous avons donc fait l’hypothèse d’une variation saisonnière du passage des stéroïdes sexuels entre les compartiments sanguin et cérébrospinal. Nous avons fait l’hypothèse de l’implication de la Pgp dans la séquestration des stéroïdes dans le LCS.

Dans ce but, nous avons localisé la Pgp active dans les cellules épithéliales des plexus choroïdes ovins par cytométrie de flux, révélée par son immunoréactivité à l’anticorps UIC2.

Nous avons également développé la culture primaire des cellules épithéliales des plexus choroïdes ovins ‘en insert’. Ces cultures nous permettent de mettre en évidence le transport de la progestérone et de l’oestradiol du compartiment ‘LCS’ (apical), vers le compartiment sanguin (basal). L’augmentation de ces transports par le vérapamil renforce l’hypothèse de l’implication de la Pgp dans la rétention des stéroïdes sexuels dans les ventricules cérébraux. Ce modèle devrait nous permettre à terme d’étudier les intermédiaires hormonaux ou humoraux susceptibles de mimer la modulation de la perméabilité observée in vivo.

 

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Epression of mdr1 is required for sustaining stem cells in dystrophic muscle

 David Israeli, Simin Ziaei, Bernard Gjata, Rachid Benchaouir, Philippe Rameau, Patrick Gonin, Olivier Danos, Luis Garcia

Genethon, CNRS UMR 8115, EVRY, France

 In a recent study conducted in our laboratory we have identified and sorted “side population” (SP) cells from myoblast cultures. In addition to the presentation of the SP phenotype these cells presented other features in common with stem cells, including G0-cell cycle arrest and reduced expression of tissue-specific transcription factors (Benchaouir et al., 2004) . The SP cells expressed several members of the ABC-transporter family, including mdr1a, mdr1b and ABCG2. Treatment of the myoblast cultures by FGF6, a muscle-specific growth and regeneration factor, resulted in about a 100 fold increased mdr1a expression, while the level of mdr1b and ABCG2 remained unchanged. Moreover, the FGF6 treated culture presented 20 fold increased in the proportion of SP cells (Israeli et al., 2004) . mdr1 is expressed in a wide variety of adult stem cells and posses an anti-apoptotic activity. In view of the above results we have hypothesized a role for mdr1 in the muscle regeneration machinery, possibly in the protection of the muscle stem cells pool from exhaustion.

The dystrophin deficient mdx mouse is characterized by relatively mild overall symptoms. The efficient muscle regeneration capacity of mdx mouse is supported by a non-exhaustive muscle stem cell reservoir and perseverance muscle regeneration.

To test a role for mdr1 in stem cells homeostasis we have crossed the mdr1-deficient mouse with the mdx mouse. 

The out come triple knockout mice (deficient for mdr1a, mdr1b and dystrophin) have born and developed normally and are fertile, however they present enhanced muscle degeneration, reduced percentage of muscle SP cells, reduced muscle content of desmin-positive cells and a reduced muscle regeneration capacity compared to mdx mouse. We concluded that in the mdx mouse mdr1 plays a central role in the preservation of the muscle stem cells and therefore in the muscle regeneration mechanism. We suggest a central role for mdr1 in a stress-induced tissue regeneration genetic program.

 

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  , Leulliot N.², Sizun C.¹, Ulryck N.², Pamlard O.¹, Quevillon-Cheruel S.², Lallemand J.Y.¹, Van Tilbeurgh H.² et Jacquet E.¹

 

¹ : Institut de Chimie des Substances Naturelles, UPR2301, Centre National de la Recherche Scientifique, Avenue de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex, France.

² : Institut de Biochimie et de Biophysique Moleculaire et Cellulaire, UMR8619, Bât 430, Université de Paris-Sud, 91405 Orsay Cedex, France.

 

odile.ramaen@icsn.cnrs-gif.fr, eric.jacquet@icsn.cnrs-gif.fr, Herman.Van-Tilbeurgh@ibbmc.u-psud.fr

 

 

MRP1 (Multidrug Resistance associated Protein 1 ; ABCC1) est un transporteur ABC humain capable d'exporter de la cellule, différents agents anti-cancéreux. Il possède des régions transmembranaires (TMD) proposées pour former le canal qui permet l'export des substrats, et deux domaines cytoplasmiques (NBD) qui lient l’ATP et contiennent les motifs caractéristiques des protéines ABC (WA, WB et séquence signature « LSGGQ »). L’activité de transport de drogues par MRP1 nécessite l’énergie d’hydrolyse de l’ATP par les NBD.

 

Le domaine NBD1 de MRP1 a été purifié à homogénéité. Son étude biochimique a révélée une activité ATPasique extrêmement faible en dépit d’une bonne liaison de ses substrats ADP et ATP en présence de magnésium. L’influence de la fixation des nucléotides sur le NBD1 a été caractérisée par des expériences de RMN.

 

Le domaine NBD1 a été cristallisé en présence d’ATP et de magnésium. La structure a été obtenue avec une résolution de 1,7 Angström. La comparaison de cette structure avec les NBD des transporteurs ABC montre une architecture globale conservée.

Un nouvel outil moléculaire rapporteur de l’interaction entre le transporteur ABC SUR et le canal Kir 6.2 au sein du canal K_ATP.

 Eric Hosy, Renaud DERAND et Michel VIVAUDOU

UMR 5090, Lab. Biophys. Mol. & Cell., CEA/DRDC, 17 rue des Martyrs, 38054 Grenoble.

 

Les canaux K_ATP (canaux potassiques sensibles à l’ATP), sont formés par l’assemblage d’un transporteur ABC de type MRP (le récepteur des sulfonylurées : SUR) et d’un canal potassique à rectification entrante (Kir6.2). Les canaux K_ATP étant impliqués dans de nombreuses pathologies tels que le diabète, l’hypertension et l’ischémie, les substances régulant l’activité de ces canaux présentent un potentiel pharmacologique important. La compréhension des mécanismes sous‑tendant l’activation ou l’inhibition des K_ATP par ces substances nous renseigne sur le fonctionnement du canal et sur le dialogue entre les différentes sous‑unités qui le composent.

Nous rapportons ici l’identification d’un nouvel inhibiteur se fixant spécifiquement sur Kir6.2. Son effet est toutefois modulé par la présence de la sous unité SUR ainsi que par les nucléotides. Nos observations suggèrent que ce composé s’intercale entre les deux sous unités du canal dans la zone de couplage entre SUR et Kir 6.2. L’étude de cet inhibiteur a permis de mettre en évidence un nouvel état conformationnel du canal, de définir un nouveau modèle de gating pour les K_ATP, et de mieux caractériser les interactions SUR‑Kir 6.2.

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RECHERCHE D’INHIBITEURS DE MsrA, UN ABC-TRANSPORTEUR DE STAPHYLOCOCCUS, CONFERANT LA RESISTANCE AUX MACROLIDES

 

Béatrice MARQUEZ¹, Luc NEUVILLE¹, Pascale BOUHOURS¹, Cécile BEBEAR², Bernard MAIGRET³, Nicole MOREAU¹

 

1. ENSCP, Laboratoire de Biochimie, UMR CNRS 7573, 11 rue Pierre et Marie Curie, 75005 Paris

2. Université Bordeaux II, Laboratoire de Bactériologie, 146 rue Léo Saignat, 33000 Bordeaux

3. Université Nancy I, UMR CNRS 7565, BP 239, 54506 Vandoeuvre-les-Nancy

                               

             La résistance bactérienne aux antibiotiques est un sérieux problème de santé publique, car elle concerne pratiquement toutes les classes d’antibiotiques, et ce quelque soit leur champ d’application. Dans ce contexte, il est urgent de trouver de nouvelles molécules actives contre les souches de bactéries résistantes, ou aussi, des inhibiteurs de ces mécanismes de résistance.

            Au laboratoire, nous recherchons des inhibiteurs des systèmes d’efflux bactériens, et en particulier de la pompe d’efflux MsrA de Staphylococcus aureus. Ce système d’efflux est un ABC-transporteur de classe II (deux domaines liant l’ATP, pas de domaines transmembranaires) et entraîne, chez le staphylocoque, une résistance aux antibiotiques de la classe des macrolides (à 14 et 15 chaînons) et des streptogramines B[1]^,[2].

                Nous avons tout d’abord réalisé un criblage robotisé des molécules de la “Chimiothèque Nationale du CNRS” sur la souche résistante de S. aureus MsrA. L’activité des molécules repérées lors du criblage est ensuite confirmée en mesurant leur effet sur l’accumulation intracellulaire de l’antibiotique (macrolide radiomarqué) par la souche résistante : un niveau d’accumulation comparable à celui existant chez la souche sauvage doit être restauré. Nous avons également cloné le gène msrA chez E. coli afin de pouvoir exprimer et purifier la protéine. Enfin, pour concevoir des inhibiteurs de manière rationnelle, nous avons entrepris la construction d’un modèle tridimensionnel de la pompe, par homologie avec les ABC-transporteurs cristallisés.

                Nous avons testé environ 3 000 molécules et extraits naturels de plantes, provenant de différents laboratoires de chimie. Nous avons ainsi pu identifier des molécules, dépourvues d’activité antibactérienne intrinsèque, mais présentant une activité inhibitrice de la pompe. Les mesures d’accumulation de l’antibiotique par la souche de S. aureus MsrA, en présence de ces molécules, sont en cours. Deux modèles tridimensionnels de la pompe ont été construits et sont en cours de validation.

                Lorsqu’un modèle tridimensionnel de MsrA sera validé, nous pourrons l’utiliser afin de concevoir des inhibiteurs de la pompe. Nous pourrons également rendre compte de l’activité des inhibiteurs trouvés lors du criblage. Par ailleurs, la cytotoxicité de ces inhibiteurs sera évaluée et ces molécules seront également testées sur d’autres pompes d’efflux de type ABC, en particulier les pompes VgaA et VgaB de S. aureus.

 

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L’expression d’ABCA2 est régulée au cours du développement neural.

 

C. Broccardo¹, V. Nieoullon², R. Amin¹, F. Masmejean³ , S. Carta⁴, S. Tassi⁴, M. Pophillat¹, A. Rubartelli,⁴, M. Pierres¹, A. Nieoullon³, G. Chazal², G. Chimini¹.

1 Centre d’Immunologie de Marseille Luminy (CIML), Marseille, France ; 2 Institut de biologie du développement de Marseille (IBDM), Marseille, France ; 3 IC2N, Marseille, France ; 4 Cell biology laboratory, National cancer institute, Gènes, Italie

 

Le dysfonctionnement des transporteurs ABC de mammifères est souvent associé à des phénotypes pathologiques. Ceux-ci s’étendent des désordres neurologiques ou métaboliques aux résistances pléiotropiques aux drogues utilisées en chimiothérapie. En terme moléculaire un tel pléiomorphisme fonctionnel est dû à la grande diversité de substrats transportés par les membres de la famille ABC.

Les lipides sont le substrat de prédilection des transporteurs de la sous-classe A. Leur nature précise cependant est dictée par des détails structuraux et le patron d’expression des différents transporteurs ABCA.

ABCA2 est le seul membre de la sous-classe A hautement exprimé dans le système nerveux central (SNC). Ceci en fait un bon candidat comme régulateur du métabolisme lipidique cérébral considérant que ABCA1 est un élément clé dans le contrôle du niveau des HDL plasmatiques et du contenu en cholestérol de plusieurs types cellulaires.

Cependant malgré l’accumulation de preuves du rôle crucial du cholestérol dans le SNC, les mécanismes moléculaires régissant le métabolisme des stérols cérébraux ne sont que partiellement élucidés.

L’apport de cholestérol aux cellules est per se un facteur critique dans la différenciation, la survie neuronale et la synaptogenèse. De plus le transport de stérols entre neurones et cellules gliales a un impact majeur sur le taux de dégradation de protéines membranaires potentiellement impliquées dans les neurodégénérescences.

Enfin des expériences ont montré un effet bénéfique de drogues hypocholestériques sur le développement des maladies neurodégénératives.

Pour appuyer l’hypothèse d’un rôle d’ABCA2 dans le métabolisme des stérols au niveau du SNC, il était nécessaire d’étudier la régulation spatio-temporelle de son expression au cours de la différenciation neurale.

Il a été rapporté que la sur-représentation du messager d’ABCA2 dans le cerveau adulte était essentiellement due à son expression dans les oligodendrocytes au moment de la myélinisation. L’information sur l’expression dans d’autres types cellulaires était cependant très limitée. Nous avons donc entrepris une étude de l’expression neurale d’ABCA2 en se concentrant sur la différenciation neurale. L’analyse des structures cérébrales in vivo et de l’expression d’ABCA2 au cours du développement in vitro indique clairement que l’expression d’ABCA2 est région-dépéndante et régulée au cours du développement. ABCA2 est en fait largement exprimé dans les progéniteurs neuraux pluripotents alors que dans le cerveau adulte son expression se restreint aux oligodendrocytes myélinisant et à des sous-populations de neurones GABAergiques et glutamatergiques.

ABCA2 est exprimé dans des vésicules intracellulaires identifiées dans des cellules HeLa transfectées comme étant des « lysosomes-like ». Ces organelles présentes également dans les cellules neurales subissent des modifications morphologiques au cours de la différenciation.

Considérant le rôle crucial des organelles de type lysosomial dans le recyclage des stérols, que les progéniteurs neuraux ont une croissance stérol-dépendante et que le cholestérol est impliqué dans la synaptogenèse, ces données justifient le développement de modèles animaux et de systèmes fins d’étude permettant d’établir un lien entre altération de fonction d’ABCA2 et conséquences neuropathologiques.

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 Ramaen O.¹ , Pamlard O.¹, Lallemand J.Y.¹, Jacquet E.¹, Betton J.M. ² et Chesneau O.³

 

¹ : Institut de Chimie des Substances Naturelles, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Unité Propre de Recherche 2301, Avenue de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex, France.

² : Unité de Repliement et Modélisation des Protéines, Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75015 Paris, France.

³ : Unité des Agents Antibactériens, Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75015 Paris, France.

 

odile.ramaen@icsn.cnrs-gif.fr, eric.jacquet@icsn.cnrs-gif.fr, chesneau@pasteur.fr

 

 La multi-résistance aux antibiotiques des souches de staphylocoques pose un problème majeur de santé publique. De nature chimique différente, les composants A et B des streptogramines sont administrés chez l’homme tels qu’ils sont produits par les souches de streptomycètes ou modifiés de façon synthétique pour les rendre plus hydrosolubles et adaptés aux formulations injectables d’usage hospitalier. La synergie des composants A et B se manifeste par un effet bactéricide qui distingue les streptogramines des autres antibiotiques agissant sur la sous-unité 50S du ribosome. Peu de systèmes ABC de résistance aux antibiotiques ont jusqu’à présent été décrits. Parmi ceux-ci, les plus originaux sont sans doute regroupés dans la famille ARE (selon la classification établie par Elie Dassa et coll.) car on ne connaît ni leur structure ni leur mécanisme d’action vis-à-vis des macrolides, lincosamides et streptogramines.

 

Vga(A) est une protéine de 522 acides aminés, dont le gène a été cloné à partir d’un plasmide de S. aureus,  et qui confère à elle seule une résistance aux composants A des streptogramines (pristinamycine II, virginiamycine M, dalfopristine). Cette protéine ABC est caractérisée par la présence de deux domaines NBD codés par une seule chaîne polypeptidique, et par l’absence de domaines membranaires identifiés. Le domaine NBD1 est fortement dégénéré et la boucle qui relie les deux NBD forme une chaîne d’une centaine de résidus, très riche en résidus chargés. Le mécanisme par lequel cette protéine confère la résistance aux composants A des streptogramines, potentiellement par un mécanisme d’efflux, n’est pas encore élucidé.

 

Nous avons produit Vga(A) dans E. coli et nous avons purifié cette protéine recombinante. La purification nécessite plusieurs étapes chromatographiques et conduit à des rendements relativement faibles. La protéine purifiée nous a permis de caractériser son activité ATPasique et d’étudier l’influence de la présence d’antibiotiques de la famille « MLS » (Macrolides, Lincosamides, Streptogramines) sur cette activité in vitro. L’objectif de nos études consiste à améliorer notre compréhension du mécanisme d’action de ce système ABC de résistance par la caractérisation de son activité biochimique, la recherche d’éventuels partenaires protéiques et la possibilité d’interaction directe avec ses substrats.

 

  , Levaique H., Bignon J., Lallemand JY. et Jacquet E.

 

Institut de Chimie des Substances Naturelles, UPR2301, Centre National de la Recherche Scientifique, Avenue de la Terrasse, 91198 Gif-sur-Yvette Cedex, France.

 

edith.garrido@icsn.cnrs-gif.fr, eric.jacquet@icsn.cnrs-gif.fr

 

 

Les ABC transporteurs sont responsables du transport actif de molécules de natures diverses entre les différents compartiments cellulaires. Chez l’homme, des mutations invalidantes de différents membres de cette famille sont à l'origine de maladies génétiques graves. D'autre part, il a été montré que certains ABC transporteurs (ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCC3, ABCC4, ABCC5, ABCG2) jouent un rôle important dans la détoxification de l’organisme et dans la sensibilité ou la résistance aux médicaments, notamment lors des thérapies anti-cancéreuses.

Compte tenu de l’importance des transporteurs ABC dans certaines pathologies humaines et dans le phénomène de chimiorésistance, il apparaît indispensable de pouvoir quantifier l'expression de tous les gènes codants pour les transporteurs ABC.

 

Pour effectuer ces études, nous avons développé deux puces à ADN qui nous permettent de doser spécifiquement l’expression de l’ensemble des ABC transporteurs chez l’homme et la souris. Du fait des fortes homologies de séquences qui existent entre les gènes de cette famille, nous avons défini pour chaque transporteur ABC, trois sondes spécifiques et dans un souci de reproductibilité, chaque sonde est présente trois fois sur la lame.

En parallèle, nous avons mis au point le dosage de tous ces transporteurs (humain et murin) par la technique de RT-qPCR (Reverse Transcriptase- quantitative Polymerase Chain Reaction).

 

Ces deux techniques qui sont complémentaires, nous permettront d’avoir une vue d’ensemble de l’expression des transporteurs, dans différents organes humains et murins ainsi que dans des lignées cellulaires. Nous pourrons donc établir des corrélations entre le niveau d’expression de ces transporteurs et certaines maladies ou l'apparition d'une résistance chimio-induite.

Obtention d’anticorps monoclonaux spécifiques des transporteurs ABCA1, ABCA2 et ABCA7

 

Doriane Trompier , Sarah Scaglione, Michel Pierres, Giovanna Chimini.

Centre d’Immunologie de Marseille Luminy . Parc Scientifique de Luminy.

13288 Marseille Cedex 09. France.

 

Il n’est plus à démontrer que le développement d’anticorps monoclonaux (AcM) dirigés contre les transporteurs ABC est stratégiquement crucial pour des études structure-fonction, des analyses de topologie, la purification de protéines, voire même en vue d’une utilisation potentielle en recherche clinique.

 

Notre projet vise à développer des AcM de rat dirigés contre trois transporteurs murins actuellement étudiés au laboratoire. Le transporteur ABCA1, dont l’intérêt en pathologie humaine est acquis vu son implication dans la maladie de Tangier et dans la phagocytose des corps apoptotiques. Le transporteur ABCA2, exprimé préférentiellement dans le système nerveux central et impliqué dans le métabolisme de stérol cérébraux, serait un facteur génétique de risque pour la maladie d’Alzheimer. Et enfin, le transporteur ABCA7, phylogénétiquement proche de ABCA1 et présentant un territoire d’expression spécifiquement lymphocytaire, partage les mêmes fonctions in vitro que ABCA1 mais son rôle fonctionnel in vivo reste toujours à déterminer.

 

La présence de larges boucles extracellulaires N- et C-terminales, d’une taille respective d’environ 600 et 300 acides aminés, est une caractéristique exclusive de la sous-famille A des transporteurs ABC. Ces larges boucles constituent par conséquent des épitopes de choix pour la mise en place d’anticorps monoclonaux spécifiques.

Afin d’obtenir un panel d’AcM avec un large éventail de réactivité et de spécificité en vue de leur souplesse d’utilisation, plusieurs stratégies d’immunisation ont été utilisées. Une stratégie a été d’utiliser comme immunogène des peptides synthétiques, situés dans les larges boucles et sélectionnés en fonction du polymorphisme rat/souris et des données connues sur la topologie de ces transporteurs. Une autre stratégie a été d’utiliser comme immunogène des cellules entières surexprimant les transporteurs soit par transfection soit par activation.

 

Dans le cas d’ABCA1, l’immunisation d’un rat par des peptides synthétiques à abouti à l’obtention de 4 AcM qui se révèlent être réactifs en immunoblot. Nous avons également obtenu 8 AcM suite à l’immunisation par des cellules entières, permettant la caractérisation du transporteur natif.

En ce qui concerne ABCA7, l’approche cellulaire a été privilégiée ; 24 AcM ont été obtenus dont trois sont particulièrement versatiles, de part leur réactivité en immunoblot et en microscopie, cytométrie en flux ou immunoprécipitation.

Quant à ABCA2, seule la stratégie d’immunisation peptidique a pu être mise en place compte tenu de son expression à la membrane lysosomiale. L’immunisation par trois peptides synthétiques a abouti à la mise en place de 25 AcM dont la caractérisation est actuellement en cours.

Les transporteurs de multiples drogues des cellules cancéreuses : glycoprotéine-P,

MRP (multidrug resistance protein)1 et BCRP (breast cancer resistance protein)

A. Di Pietro, ¹ A. Ahmed-Belkacem,¹ A. Pozza,¹ D. Trompier², T. Perrotton, S. Macalou¹ & H. Cortay¹

 ¹Institut de Biologie et Chimie des Protéines, UMR5086 CNRS-UCBL1 et IFR128 BioSciences Lyon-Gerland, Lyon, ²Centre d’Immunologie de Marseille Luminy.

                Trois types de transporteurs ABC - glycoprotéine-P (ABCB1), MRP1 (ABCC1) et BCRP (ABCG2) - sont surexprimés dans les membranes plasmiques de cellules cancéreuses caractérisées par un phénotype MDR (“multidrug resistance”). Ces transporteurs présentent des topologies différentes en relation avec leur classe d’appartenance : MRP1 possède un domaine transmembranaire excédentaire TMD0 par rapport à la glycoprotéine-P, et BCRP est un demi-transporteur homodimérique, dont le domaine cytoplasmique NBD précède le domaine transmembranaire TMD dans la séquence. Bien qu’ils jouent tous un rôle dans la détoxication cellulaire de xénobiotiques, glycoprotéine-P et BCRP sont orientées du côté apical des cellules polarisées des épithéliums, alors que MRP1 est du côté basolatéral.

Leur mécanisme global de fonctionnement est similaire, l’énergie issue de l’hydrolyse d’ATP permettant le transport actif des drogues substrats. Cependant, aucune structure à haute résolution de transporteur MDR  n’est connue à ce jour : seules des structures à faible résolution par cristallisation bi-dimensionnelle et microcopie électronique, ainsi que des changements de conformation, ont été obtenues pour la glycoprotéine-P et ses homologues bactériens LmrA et BmrA, et pour MRP1, alors qu’aucune information n’est disponible pour BCRP qui n’a pas encore été purifié. Les informations structurales obtenues à haute résolution par cristallisation des NBD d’autres types de transporteurs ABC, le plus souvent bactériens, sont relativement extrapolables, et font apparaître deux sites ATP partagés entre les deux NBD, présentant d’un côté les motifs A et B de Walker et de l’autre la signature ABC. En revanche, l’agencement du domaine transmembranaire et de ses interactions avec les NBD nécessite une modélisation moléculaire à partir des structures de deux transporteurs bactériens MsbA et BtuCD, qui reste souvent sujette à caution, même en incluant les résultats de pontages chimiques issus de “cysteine-scanning”, et mutagenèse dirigée de résidus essentiels.

Les multiples substrats transportés sont caractéristiques de systèmes polyspécifiques. Les spectres de substrats, bien que recouvrants, ne sont pas identiques mais au contraire complémentaires ; ainsi, ces trois transporteurs ensemble confèrent la résistance cellulaire à un très grand nombre de composés. La glycoprotéine-P, véritable “aspirateur hydrophobe”, transporte des substrats aromatiques neutres ou cationiques. MRP1, au contaire, reconnait spécifiquement le glutathion qui est transporté soit en conjugaison avec des substrats comme le LTC4 soit co-transporté avec des substrats hydrophobes comme la vincristine. BCRP transporte également des substrats sulfatés, mais sa spécificité est très dépendante de la mutation de l’arginine 482 en thréonine ou glycine qui fait perdre la capacité de transport du métothrexate, en autorisant celui de la rhodamine.

En revanche, la spécificité pour les modulateurs semble plus étroite, permettant d’envisager l’inhibition sélective de chaque transporteur. Des inhibiteurs très hydrophobes ont été identifiés, comme des prénylflavonoïdes ou des stéroïdes substitués par des groupements aromatiques, mais ces composés sont relativement toxiques ; quelques composés de troisième génération ont réussi à atteindre les tests cliniques de phase 3 (GF120918, LY335979, XR9576, OC144-093). MRP1 présente l’inconvénient d’avoir des substrats chargés ; ainsi, les inhibiteurs caractéristiques comme le probénécide et la MK571 sont peu efficaces du fait de problèmes d’accessibilité. Une nouvelle statégie intéressante concerne la stimulation de l’activité de transport de MRP1 par des dérivés hydrophobes de type vérapamil qui produisent un efflux massif du glutathion intracellulaire, induisant ces cellules MDR en apoptose. BCRP est inhibé par des flavonoïdes hydrophobes avec une spécificité différente de la glycoprotéine-P mais comparable à celle observée pour Pdr5p, un transporteur de levure appartenant également à la classe G des ABC.

The multifunctionality of plant ABC transporters

 Enrico Martinoia

Institut für Pflanzenbiologie, Universität Zürich, Zollikerstrasse 107, 8008 Zürich, Switzerland

 

 

The recent completion of the genomic sequencing of Arabidopsis revealed that 131ABC transporters are present in this organism. In our laboratory we focus on the MRP subclass of ABC transporters and on some members of the PGP/MDR subclass.

Some MRPs class are involved in the last step of cellular detoxification, the vacuolar deposition of modified toxic compounds. Our work with T-DNA deletion mutants show, that several MRPs are involved in the vacuolar deposition of modified toxic compounds. Some other MRPs are involved in the regulation of ion transport. In the case of AtMRP5 stomata regulation is completely deregulated and deletion mutants for this gene are more water stress tolerant. In contrast, deletion mutants for AtMRP4 show constitutively larger stomata aperture and a decreased water stress tolerance; however, regulation does not appear to be affected.

Recently we have shown that several ABC transporters belonging to the MDR family of Arabidopsis can interact with immunophilins. The drastic phenotype observed for knockout mutants of immunophilins suggests that ABC transporters are also involved in developmental processes. Indeed careful transport analysis revealed that two MDRs participate in auxin transporter and probably form multiprotein complexes.

In my talk I will give a general overview on the work with ABC transporters carried out in our laboratory and give special emphasis on guard cell regulation and on our new observation that ABC transporters are part of the phytohormone transport machinery.

CFTR-related diseases

Cuppens Harry

Center for Human Genetics, KULeuven, Leuven, Belgium

 

One of the more famous ABC-proteins is the CFTR protein. The CFTR protein was found after a very competitive search for the defective protein in cystic fibrosis (CF).

The CFTR protein encodes an epithelial chloride channel, however it regulates, and is regulated by, several other proteins, such as the amiloride sensitive epithelial sodium (ENaC) channel. Apart from the defective chloride secretion, the increased sodium absorption even aggravates the basic defect in CF. In fact, transgenic mice overexpressing the beta-subunit of the ENaC channel even result in similar CF-like symptoms, in contrast to true CFTR knockouts. Also bicarbonate transport is affected by CFTR.

More than 1300 mutations have been identified in the CFTR gene, F508del being the most frequent mutation. Based on the repercussions at the protein level, CFTR mutations can be divided in 5 classes. The first 3 classes of CFTR mutations are known as severe mutations, because of no protein synthesis, no protein maturation, or defective regulatory properties of the channel. The last 2 classes of CFTR mutations are known as mild mutations, because either the conductive CFTR properties are affected to some extent, or some functional CFTR protein is still made. The recognition that mutations can be divided in different classes is of therapeutic interest, since different strategies might be employed aiming at correcting a certain class of CFTR mutations. Indeed, a general approach for treatment for CF, such as gene therapy, is not feasible yet.

Patients harboring a milder mutation on a least one CFTR gene have milder disease. In fact, it has been found that CFTR is involved in other diseases than CF, such as congenital bilateral absence of the vas deferens (CBAVD), and even true multifactorial diseases such as disseminated bronchiectasis and chronic pancreatitis. The most frequent mild mutant CFTR gene in CBAVD patients is the T5 allele. The T5 allele is a rather frequent allele at the polymorphic Tn locus, with partial penetrance as a disease mutation. This Tn locus results in alternative exon 9 splicing, and translates to a CFTR protein that does not mature. The penetrance as a disease mutation is explained by a polymorphic TG repeat. Although most CBAVD patients carry mutations on both CFTR genes, most of them do not present lung disease. This might be explained by the fact that alternative splicing of exon 9 is variable between tissues and is increased in testicular tissues compared to lung tissue.

But even in CF patients, the CF phenotype can be quiet variable and has multifactorial features. In recent years, modulating genes have been identified that affect the CF phenotype, the most well known being mannose binding lectin protein. In fact, even after extensive screening, a mutation cannot be found on all CFTR genes of CF patients. In Western Europe, a mutation cannot be found in about 1-3% of the CFTR genes derived from CF patients. In a smaller proportion, large CFTR-DNA-rearrangements are involved, but there is evidence for other genes than CFTR in a subset of CF patients. Also, from cross-species analysis of complete genomic CFTR regions, it is found that other regions than exons are conserved which suggest functional properties of these intergenic regions, which might in the end be involved in CFTR-related diseases.

From a genetic point of view, the identification of the CFTR gene was a milestone, but CFTR is still paving the way of research in the genetic community. 

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Structure et fonction de SUR, une protéine ABC régulatrice de canaux potassiques

Michel Vivaudou

Laboratoire de Biophysique Moléculaire et Cellulaire

CNRS UMR5090, CEA/DRDC, 17 rue des Martyrs, 38054 Grenoble, France

 

Le récepteur des sulfonylurées (SUR pour SUlfonylurea Receptor; ABBC7/8) est une protéine ABC de la famille ABCC/MRP. Sa structure le rapproche des autres protéines de cette famille, dont MRP1 (multidrug resistance protein 1), YCF1 (yeast cadmium factor 1), AtMRP5 (A. Thaliana MRP5), et CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator). Néanmoins, sa fonction est unique parmi toutes les protéines ABC puisqu'il n'est ni un véritable transporteur actif comme MRP1 – il n'a aucune fonction de transport connue – ni un véritable transporteur passif comme le canal chlorure CFTR. Son seul rôle connu est de réguler indirectement l'ouverture et la  fermeture d'un canal potassique, Kir6.2 (ou Kir6.1), dont il est le partenaire indéfectible et indissociable.

L'association SUR-Kir6.2 forme le canal potassique sensible à l'ATP (K-ATP), présent dans les neurones, les muscles, les cellules endocrines,... , où il sert à ajuster l'excitabilité membranaire de la cellule à son métabolisme interne. Dans ce couple, Kir6.2 mesure l'ATP intracellulaire alors que SUR mesure l'ADP via ses domaines de liaison de nucléotides (NBD) par un mécanisme encore mal compris. SUR est aussi la cible de nombreux agents pharmacologiques d'importance thérapeutique considérable (antidiabétiques, antihypertensifs, antiischémiques, etc.).

Nos travaux s'attachent à examiner les mécanismes moléculaires de la régulation physiologique et pharmacologique du canal K-ATP via SUR et à comprendre les bases structurales de l'interaction SUR-Kir6.2. Nos résultats illustrent le potentiel des techniques électrophysiologiques disponibles pour étudier SUR et l'intérêt de SUR en tant que modèle d'étude des protéines ABC eucaryotes.

 

Références:

Moreau C, Jacquet H, Prost AL, D'Hahan N, Vivaudou M (2000) The molecular basis of the specificity of action of K-ATP channel openers. EMBO J. 19:6644-6651

Terzic A, Vivaudou M (2001) Molecular pharmacology of ATP-sensitive K+ channels: How and why? In: Potassium channels in Cardiovascular Biology, Ed. S. Archer and N. Rusch, Kluwer/Plenum, pp257-277

Prost A, Bloc A, Hussy N, Dérand R, Vivaudou M (2004) Zinc is both an intracellular and extracellular regulator of K_ATP channel function. J. Physiol-London. 559:157-67

Moreau C, Gally F, Jacquet-Bouix H, Vivaudou M (2005) The size of a single residue of the sulfonylurea receptor dictates the effectiveness of K_ATP channel openers. Mol. Pharm. 67:1026-33

Moreau C, Prost AL, Dérand R, Vivaudou M (2005) SUR, ABC proteins targeted by K_ATP channel openers. J. Mol. Cell. Cardiol. 38:951‑63

 

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The Bacterial Multidrug ABC Half-Transporter BmrA mainly adopt a closed dimeric conformation in the resting state: A Lifetime FRET Study

 

Olivier Dalmas¹, Marie-Ange Do Cao¹, Cédric Orelle¹, Miguel R. Lugo², Frances J. Sharom²,

Attilio Di Pietro¹ & Jean-Michel Jault³

 

¹Institut de Biologie et Chimie des Protéines, UMR 5086 CNRS-UCBL1 and IFR 128, 7 passage du Vercors, 69367 Lyon Cedex 07, France ;

²Department of Molecular and Cellular Biology, University of Guelph, Guelph, Ontario, Canada N1G 2W1;

³Laboratoire de Biophysique Moléculaire et Cellulaire, DRDC, UMR 5090 CNRS/CEA/UJF, CEA 17 rue des Martyrs, Bâtiment K, 38054 Grenoble Cedex 9, France.

 

  Members of the ATP-binding cassette (ABC) transporters share the same basic architecture, with a four core domains made of two transmembrane plus two nucleotide-binding domains. However, a supramolecular organization has been detected in some ABC transporters which might be relevant to physiological regulation of substrate transport. Here, the oligomerization status of a bacterial half-ABC multidrug transporter, BmrA, was investigated. Each BmrA monomer containing a single cysteine residue introduced close to either the Walker A or the ABC signature motifs was labeled using two probes, 2-(4-maleimidoanilino)naphthalene-6-sulfonic acid (fluorescence donor) or 4-dimethylaminophenylazophenyl-4'-maleimide (fluorescence acceptor). Reconstitution into proteoliposomes of BmrA monomers labeled separately with either the fluorescence donor or the fluorescence acceptor allowed measurement of time-resolved fluorescence resonance energy transfer between the two probes, showing that efficient re-association of the singly-labeled BmrA monomers occurred upon reconstitution. The efficiency of energy transfer studied as a function of increasing concentration of BmrA-labeled with the fluorescence acceptor argues for a dimeric association of BmrA instead of a tetrameric one. Furthermore, the efficiency of energy transfer allowed estimation of the distances between the two bound probes. Results suggest that, in the resting state, BmrA in a lipid bilayer environment preferentially adopts a closed conformation similar to that found in the BtuCD crystal structure, and that the presence of different effectors does not substantially modify its global conformation.

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Specific inhibition by chrysin derivatives of ABCG2-mediated mitoxantrone efflux

and role of the R482T hot spot mutation.

 

 

Abdelhakim Ahmed-Belkacem¹, Alexandre POZZA¹, Sira MACALOU¹,

José M. PEREZ-VICTORIA² & Attilio Di Pietro¹

 

¹ Institut de Biologie et Chimie des Protéines, UMR 5086 CNRS-UCBL1 and IFR 128, 7 passage du Vercors, 69367 ;

² Institut de Parasitologie et Biomédecine de Grenade, Espagne.

 

 The ABCG2 multidrug transporter, also called BCRP (“breast cancer resistance protein”), is involved in cancer cell resistance to chemotherapy, but few selective inhibitors are available. Structure-activity relationships drawn from a rational screening of flavonoids as inhibitors of mitoxantrone efflux identified 6‑prenylchrysin as a potent and specific compound, able to revert multidrug resistance and chemosensitize cell growth. Interestingly, the hot-spot R482T mutation, known to change substrate spectrum, also altered the impact of flavonoid inhibition by limiting the positive effect of flavonoid prenylation on ABCG2 inhibition, tectochrysin being the most efficient.

 

While GF120918 strongly inhibited the ATPase activity of wild-type ABCG2, neither 6-prenylchrysin nor tectochrysin altered the activity, suggesting that the compounds did not interfere with ATP binding. In contrast, all three inhibitors stimulated the ATPase activity of mutant ABCG2. Both flavones exhibited a lower intrinsic cytotoxicity than GF120918 and were apparently not transported by ABCG2. 6‑Prenylchrysin and tectochrysin therefore constitute new and promising inhibitors for the reversal of ABCG2-mediated drug transport.

 

                Since the two derivatives have been proposed here to inhibit ABCG2 in a different way than GF120918, fumitremorgin C and Ko 143, we are investigating pluri-modulation by combining low concentrations of these flavones (or more potent derivatives) with low concentrations of other inhibitors interacting at different sites on the same transporter, with the aim to get additive or even synergistic modulatory effects.

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ETUDE DE L’ETAT CONFORMATIONNEL DE BmrA

PAR SDSL-EPR SPECTROSCOPIE

 

Marie-Ange DO CAO¹, Olivier DALMAS¹, Cédric ORELLE¹, Christophe GEOURJON¹, Serge CROUZY², David S. CAFISO³, Attilio DI PIETRO¹ et Jean Michel JAULT²

 

¹Institut de Biologie et Chimie des Protéines, UMR 5086 CNRS-UCBL et IFR 128 BioSciences Lyon-Gerland, 7 passage du Vercors 69367 Lyon Cedex 07

²Laboratoire de Biophysique Moléculaire et Cellulaire, DRDC, UMR 5090 CNRS/CEA/UJF, CEA 17 rue des Martyrs, Bâtiment K, 38054 Grenoble Cedex 9

³Department of Chemistry, University of Virginia, Charlottesville, Virginia 22901, USA

 

 

Chez Bacillus subtilis, une protéine fortement homologue à chaque moitié de la Pgp a été identifiée au sein de notre laboratoire (Steinfels et al., Biochim. Biophys. Acta, 2002, 1565, 1-5). Celle-ci a été surexprimée en grande quantité chez E. Coli et une caractérisation fonctionnelle a pu être réalisée. Il a ainsi été montré que cette protéine possédait une activité ATPase élevée, et était capable de transporter différentes drogues qui s’apparentent à celles de la Pgp. Elle a ainsi été baptisée BmrA pour Bacillus subtilis Multidrug Resistance ATP (Steinfels et al., Biochemistry, 2004, 43, 7491-7502).

 

Plusieurs structures cristallographiques de transporteurs ABC entiers ont été obtenues à forte résolution et sont sujet à controverse, car elles représentent la protéine soit dans une conformation ouverte, soit dans une conformation fermée. Afin de déterminer la conformation préférentiellement adoptée par BmrA en absence de nucléotides, nous avons modélisé BmrA. Tout d’abord, dans la conformation ouverte, d’après la structure de MsbA de E.coli (Chang et al., Science, 2001, 293, 1793-1800) et ensuite, dans la conformation fermée : le premier modèle utilise « toute » la protéine MsbA de V. Cholera (Chang et al., J. Mol. Biol., 2003, 419-430) comme empreinte, alors que le deuxième  utilise les domaines transmembranaires de MsbA de V.Cholera, avec l’arrangement dimérique selon BtuCD (Locher et al., Science, 2002, 296, 1091-1098) .

 

Une région particulière a ainsi été étudiée, cette dernière étant soit une hélice dans la conformation ouverte, soit une boucle dans la conformation fermée. La technique de SDSL-EPR (Site-Directed Spin Labeling Electron Paramagnetic Resonance) spectroscopie a été employée. En effet, après mutagénèse dirigée pour introduire une cystéine, et greffage d’une sonde paramagnétique sur ce résidu, des informations sur la structure secondaire et tertiaire de la protéine peuvent être déduites. (Columbus et al., Trends in Biochemical Sciences, 2002, 27, 288-295). Après avoir vérifié l’effet de la mutation et l’effet du marquage sur la protéine, BmrA a été reconstituée en protéoliposomes, et les données acquises en EPR mettent en évidence une région flexible et non structurée. Ceci suggère que BmrA adopte préférentiellement une conformation fermée avec les NBD arrangés selon BtuCD en absence de nucléotides, et confirme les résultats des expériences de FRET (Dalmas et al., Biochemistry, 2005,44 (11) 4312-4321).

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